微生物限度檢測原理和應用范圍

微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產實踐中都具有重要的意義，本文對生長量測定法、微生物計數法、生理指標法和商業化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十余種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應用范圍和優缺點。
　　一個微生物細胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養物質，并按自己的代謝方式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質的總量（重量，體積，大小）就不斷增加，于是出現了個體的生長現象。如果這是一種平衡生長，即各細胞組分是按恰當的比例增長時，則達到程度后就會發生繁殖，從而引起個體數目的增加，這時，原有的個體已經發展成一個群體。隨著群體中各個個體的進一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有困難，通常情況下也沒有實際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴增。微生物的生長繁殖是其在內外各種環境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標，同時，微生物在生產實踐上的各種應用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測方法。既然生長意味著原生質含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來進行衡量。
　　1. 微生物計量法
　　1.1 體積測量法
　　又稱測菌絲濃度法，通過測定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取量的待測培養液（如10 mL）放在有刻度的離心管中，設定的離心時間（如5 min）和轉速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物，結果會有偏差。
　　稱干重法
　　可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將體積待測培養液倒入離心管中，設定的離心時間和轉速，進行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進行真空干燥。稱干重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
　　1.3 比濁法
　　微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發酵工業菌體生長監測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600 nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.coli的生長及誘導時間。
　　1.4 菌絲長度測量法
　　對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定時間內菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。
　　2. 微生物計數法
　　2.1 血球計數板法
　　血球計數板是一種有結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個平臺上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計大格內微生物的數量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。
　　2.2 染色計數法
　　為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。借助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。
　　2.3 比例計數法
　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標準。
　　2.4 液體稀釋法
　　對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養液的試管中，經培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查大或然數表MPN（Most Probable Number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物*。